Caspase-6活性檢測試劑盒細胞增殖

Caspase-6 Activity Assay Kit (Colorimetric)

Caspase-6活性檢測試劑盒（比色法）

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Caspases（Cysteine-requiringAspartate Proteases）是一個(gè)高度保守的半胱an酸蛋白酶家族，特異性識別底物中的天冬氨酸殘基，在介導細胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著(zhù)非常重要的作用。Caspases以潛在酶原的形式表達，通過(guò)自發(fā)蛋白分解機制或經(jīng)其他蛋白酶（通常是其他caspases）加工處理的方式被活化。人caspases可細分為三大功能組：細胞因子活化（caspase-1，-4，-5和-13），凋亡啟動(dòng)（caspase-2，-8，-9和-10）和凋亡執行（caspase-3，-6和-7）。

Caspase-6（Caspase 6），也稱(chēng)為Mch-2，執行caspases組中主要的成員之一，在凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用。一旦凋亡誘導發(fā)生，起始caspases（比如caspase-9）被切割和激活。激活的上游caspases進(jìn)一步處理下游的執行caspases（比如：caspase-3和caspase-6），通過(guò)將它們切割成大和小亞基，從而啟動(dòng)caspase級聯(lián)反應，導致凋亡。Caspase-6主要的靶標是膜關(guān)聯(lián)蛋白Lamin A，這個(gè)蛋白被切割會(huì )引起細胞膜功能錯誤、膜起泡和最終死亡。

Caspase-6活性檢測試劑盒（比色法）（Caspase-6 Activity Assay Kit, Colorimetric or Caspase-6 Colorimetric Assay Kit）以偶聯(lián)上發(fā)色基團pNA的caspase-6序列特異性的多肽為底物。當底物被caspase-6剪切后，發(fā)色基團被釋放出來(lái)，進(jìn)而用酶標儀或分光光度計來(lái)測定其吸光值（λ=405nm或400nm）。通過(guò)計算OD凋亡誘導組/OD陰性對照組的比值來(lái)確定凋亡誘導組caspase-6的活化程度。

本品適用于培養細胞以及新鮮組織的caspase-6活性檢測。

產(chǎn)品包裝

保存與運輸方法

保存：-20℃保存，1年有效。開(kāi)盒后置Lysis Buffer和2× Reaction Buffer于2-8℃保存。Caspase-6 Substrate和0.1M DTT需要避光凍存。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1） Caspase-6 Substrate需避光保存和使用。

2） 某些凋亡誘導劑誘導的凋亡可能通過(guò)caspase-6非依賴(lài)的方式進(jìn)行，此種情況使用本品檢測的caspase-6活性無(wú)明顯變化，則，需要考慮凋亡機制中的其他信號通路。

3） 起始細胞數量需達3~5×106個(gè)或新鮮組織量達50~100mg，以保證達到測定所需的100~200μg蛋白量。Caspase-6的活性與細胞裂解后的蛋白含量有關(guān)，如測定的OD值偏低，可通過(guò)增加細胞數量或組織量的方法來(lái)提高蛋白量。

4） 優(yōu)先選擇測定λ=405nm的吸光值；如有困難，再測定λ=400nm的吸光值。

5） 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并戴一次性手套操作。

使用方法

1.需要的其他試劑和材料

儀器：低溫高速離心機、酶標儀或分光光度計（100μl的比色皿）（λ=405nm或400nm）、微量移液器、玻璃勻漿器（組織樣本）

耗材：1.5ml微量離心管、96孔酶標板（透明）或100μl的比色皿

試劑：PBS、蛋白定量試劑（比如：Bradford法蛋白濃度測定試劑盒）

2.試劑準備

2.1 Lysis Buffer（含DTT）

于實(shí)驗前，按每50μl Lysis Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的裂解工作液，置于4℃或冰上待用。

2.2 2×Reaction Buffer（含DTT）

于使用前，按每50μl 2×Reaction Buffer 加入0.5μl DTT的比例準備足量的反應工作液。

3.樣本準備

3.1 細胞裂解

a）用合適方法誘導細胞凋亡，同時(shí)設立陰性對照組（不加誘導劑），收集3~5×106個(gè)細胞。

b）PBS洗滌細胞2次（2000rpm，離心5min），盡量吸盡PBS上清。

c）往離心的沉淀細胞中加入15~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），吹打混勻。

d）置冰上裂解20~60min，其間渦旋振蕩3~4次，每次10s；或凍融2~3次。

e）4℃，10,000rpm離心1min。

f）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。

g）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

3.2 組織裂解

a）取50~100mg組織置于培養皿內，用手術(shù)剪剪碎成3mm×3mm左右的小塊，加入150~200μl預冷的Lysis Buffer（含DTT），用玻璃勻漿器上下手動(dòng)勻漿15次，注意低溫操作。

b）將組織勻漿液轉移到1.5ml預冷的離心管，10,000rpm，4℃離心5min。

c）小心吸取上清（含裂解釋放的蛋白質(zhì)）轉移到新的EP管內，置于冰上待用。

d）取少量上清（1~2μl），用常規方法（Bradford法）測定蛋白濃度。

4.Caspase-6活性檢測

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