轉基因植物研究農桿菌轉化法（Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation）：
根癌農桿菌感受態(tài)細胞（EHA101，EHA105，LBA4404，GV3101，AGL1）
發(fā)根農桿菌感受態(tài)細胞（MSU440，C58C1，K599，Ar A4，Ar.Qual，Ar 1193）
農桿菌介導的植物轉化方法（僅作交流學(xué)習用）
實(shí)驗目的：
根癌農桿菌介導的擬南芥轉化實(shí)驗（來(lái)自網(wǎng)絡(luò )資料）
實(shí)驗原理：
農桿菌對雙子葉植物的創(chuàng )傷部位侵染廣泛，在某些條件下對單子葉植物也有一定的感染性。
根癌農桿菌含有Ti 質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒上的T-DNA在Vir區（virulence region）基因產(chǎn)物的介導下可以插入到植物基因組中，誘導在宿主植物中瘤狀物的形成。因此，將外源目的基因插入到T-DNA 中，借助Ti質(zhì)粒的功能，使目的基因轉移進(jìn)宿主植物中并進(jìn)一步整合、表達。
實(shí)驗材料：
重組雙元表達載體pCAMBIA1300 ，GV3101農桿菌感受態(tài)細胞，擬南芥
實(shí)驗試劑：
浸染液：1/2MS，1×B5維生素，5%蔗糖，50ml/L Silwet L-77， 0.044mM 6-芐氨基嘌呤（6-BA）(10ml/L of 1 mg/ml stock in DMSO) 。 或使用只加入5%蔗糖和50-500ul/L Silwet L-77的水溶液作為浸染液。
實(shí)驗步驟：
1. 擬南芥的培養
將擬南芥種子經(jīng)10%雙氧水消毒后接種于MS培養基上，于22℃、光照10h培養1-2周，長(cháng)出無(wú)菌苗后轉移至坧石和土（3：1）混合物上培養?！咀⒁猓簼穸纫笠恍?/span>
2. 成功轉化雙元載體的農桿菌GV3101懸浮液（對數生長(cháng)期）
將目的基因構建到雙元載體上，之后，將重組的雙元載體轉入農桿菌GV1301并用卡那霉素（50mg/ml）篩選含有重組雙元載體的菌落。將農桿菌接種在LB 液體培養基（含有慶大霉素25mg/L用于篩選Ti質(zhì)粒，卡那霉素50mg/L 用于篩選T-DNA）中，28℃，180r/min條件下震蕩培養至對數生長(cháng)期，T-DNA 28℃，180r/min 在4℃和-20℃分別保存菌株備用。
3. 農桿菌感染擬南芥
3.1 在轉化前三天，接種含有雙元載體的農桿菌到5ml含有抗生素（慶大霉素20mg/L，卡那霉素50mg/L）的LB液體培養基中，28℃下震蕩培養2天。
3.2 兩天后，將1ml培養的農桿菌轉移到100ml含有抗生素的 LB液體培養基中，28℃繼續震蕩培養24h。（前面步驟由實(shí)驗技術(shù)人員準備：保證每組有約80ml-100ml 的農桿菌，事先分裝到兩個(gè)50ml的離心管中。）
3.3 將農桿菌轉入離心管中，6000rpm/min，室溫條件下， 離心10min，然后將上清倒出。
3.4 將沉淀用200ml浸染液重懸，形成均勻的農桿菌懸浮液 （OD600=0.8左右），并將農桿菌懸浮液轉移到一個(gè)敞口的器皿中（500ml燒杯）。
3.5 選取初果期的健壯植株，帶盆缽一起倒扣于盛有農桿菌懸浮液的容器上方，將整個(gè)花序浸入上述農桿菌懸浮液中約20-30s，注意葉片盡量不與浸染液接觸。同一個(gè)燒杯中的農桿菌懸浮液可以轉化10株或者更多株擬南芥。
3.6 將盆缽取下，橫放于暗箱中約24h。注意保持一定的濕度。
3.7 24h后將處理過(guò)的擬南芥植株放于22～25℃的光照條件下使其正常生長(cháng)。
3.8 大約三周后收取成熟種子。
4. 注意事項
4.1 在箱底撒水保濕，然后將花盆平放到箱子中，并用塑料袋罩住箱子暗培養16-24h（過(guò)夜）后，將擬南芥放置于塑料培養池內，并澆足Horgland營(yíng)養液，恢復正常培養。
4.2 為了提高轉化率，去除塑料袋3天后，用吸管吸取適量重懸目的質(zhì)粒的新鮮轉化液，逐個(gè)醮沾花蕾。
4.3 轉化后擬南芥的培養恢復正常管理，一旦再出現側蘗或主苔出現分枝，及時(shí)剪除。
4.4 轉化5-6周后，為了加速擬南芥成熟可以適量少澆營(yíng)養液。待擬南芥個(gè)別角果開(kāi)始枯黃后，可將其角果剪下放于培養皿內干燥。擬南芥角果大部分。
4.5 枯黃后，即可收取全部種子存于1.5ml 的EP管中（在蓋上扎一小孔以便干燥）。種子*干燥后，放于1.5ml 新EP管中4℃短期保存。如需要可放于-20℃冰箱內長(cháng)期保存。
產(chǎn)品信息：我司（上海懋康生物）提供一系列農桿菌介導的轉基因植物研究用產(chǎn)品，從雙元載體（binary vectors），到農桿菌感受態(tài)細胞（competent cells），到常用植物培養基，到植物生長(cháng)調節劑/誘導劑，到轉化篩選用的抗生素，所有產(chǎn)品現貨供應，專(zhuān)為植物研究人員而設計。如果你需要更多關(guān)于產(chǎn)品或實(shí)驗相關(guān)的問(wèn)題，咨詢(xún)。
一、常用的植物雙元表達載體 | |||||
貨號 | 名稱(chēng) | 規格 | 目錄價(jià)（元） | 載體抗性 | 篩選標記 |
MF3701-5UG | pCAMBIA1300 Vector | 5μg | 1200 | 卡那霉素Kan | 潮霉素HygR |
MF3702-5UG | pCAMBIA1301 Vector | 5μg | 1200 | 卡那霉素Kan | 潮霉素HygR |
MF3703-5UG | pCAMBIA1305.1 Vector | 5μg | 1500 | 卡那霉素Kan | 潮霉素HygR |
MF3704-5UG | pCAMBIA1305.2 Vector | 5μg | 1500 | 卡那霉素Kan | 潮霉素HygR |
MF3706-5UG | pCAMBIA2300 Vector | 5μg | 1200 | 卡那霉素Kan | 新霉素Neo |
MF3707-5UG | pCAMBIA2301 Vector | 5μg | 1200 | 卡那霉素Kan | 新霉素Neo |
MF3721-5UG | pBI121Vector | 5μg | 1500 | 卡那霉素Kan | 新霉素Neo |
MF3722-5UG | pBI121-EGFP Vector | 5μg | 1500 | 卡那霉素Kan | 新霉素Neo |
MF3724-5UG | pBI221 Vector | 5μg | 1450 | 氨芐青霉素Amp | / |
MF3725-5UG | pBI221-EGFP Vector | 5μg | 1200 | 氨芐青霉素Amp | / |
MF3731-5UG | pRI101-AN Vector | 5μg | 2000 | 卡那霉素Kan | 遺傳霉素NPT II |
二、常用的根癌農桿菌感受態(tài)細胞 | ||||
貨號 | 名稱(chēng) | 規格 | 目錄價(jià)（元） | 農桿菌類(lèi)型 |
MF2301-1000UL | EHA101化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 280 | 根癌農桿菌 |
MF2301-5000UL | EHA101化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1220 | 根癌農桿菌 |
MF2302-1000UL | EHA105化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 280 | 根癌農桿菌 |
MF2302-5000UL | EHA105化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1220 | 根癌農桿菌 |
MF2303-1000UL | LBA4404化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 280 | 根癌農桿菌 |
MF2303-5000UL | LBA4404化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1220 | 根癌農桿菌 |
MF2304-1000UL | GV3101化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 280 | 根癌農桿菌 |
MF2304-5000UL | GV3101化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1220 | 根癌農桿菌 |
MF2305-1000UL | AGL1化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 280 | 根癌農桿菌 |
MF2305-5000UL | AGL1化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1220 | 根癌農桿菌 |
MF2306-1000UL | EHA101電轉感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 600 | 根癌農桿菌 |
MF2306-5000UL | EHA101電轉感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 2400 | 根癌農桿菌 |
MF2307-1000UL | EHA105電轉感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 600 | 根癌農桿菌 |
MF2307-5000UL | EHA105電轉感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 2400 | 根癌農桿菌 |
MF2308-1000UL | LBA4404電轉感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 600 | 根癌農桿菌 |
MF2308-5000UL | LBA4404電轉感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 2400 | 根癌農桿菌 |
MF2309-1000UL | GV3101電轉感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 600 | 根癌農桿菌 |
MF2309-5000UL | GV3101電轉感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 2400 | 根癌農桿菌 |
MF2310-1000UL | AGL1電轉感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 600 | 根癌農桿菌 |
MF2310-5000UL | AGL1電轉感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 2400 | 根癌農桿菌 |
三、常用的發(fā)根農桿菌感受態(tài)細胞 | ||||
貨號 | 名稱(chēng) | 規格 | 目錄價(jià)（元） | 農桿菌類(lèi)型 |
MF2451-1000UL | MSU440化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2451-5000UL | MSU440化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2453-1000UL | C58C1化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2453-5000UL | C58C1化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2455-1000UL | K599化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2455-5000UL | K599化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2457-1000UL | Ar A4化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2457-5000UL | Ar A4化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2459-1000UL | Ar Qual化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2459-5000UL | Ar Qual化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2461-1000UL | Ar 1193化學(xué)感受態(tài)細胞 | 10×100μl | 430 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2461-5000UL | Ar 1193化學(xué)感受態(tài)細胞 | 50×100μl | 1830 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2452-0500UL | MSU440電轉感受態(tài)細胞 | 10×50μl | 720 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2452-2500UL | MSU440電轉感受態(tài)細胞 | 50×50μl | 3000 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2458-0500UL | Ar A4電轉感受態(tài)細胞 | 10×50μl | 720 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2458-2500UL | Ar A4電轉感受態(tài)細胞 | 50×50μl | 3000 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2460-0500UL | Ar 1193電轉感受態(tài)細胞 | 10×50μl | 720 | 發(fā)根農桿菌 |
MF2460-2500UL | Ar 1193電轉感受態(tài)細胞 | 50×50μl | 3000 | 發(fā)根農桿菌 |
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